研究冠状病毒40年的病毒学家:它的过去和未来(图)

【编者按】

冠状病毒属巢式病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，为有包膜的正股单链RNA病毒，直径为80-120纳米，约有3万个碱基组成，其遗传物质是已知RNA 病毒中最大的。而自1965年分离出首个人类冠状病毒至今，已有7种人类冠状病毒被发现可引发不同程度的疾病。

最近为人所知的的是2020年1月被中国科学家发现的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）,其引发的新冠肺炎疫情自去年年底开始席卷了国内外，截至目前全球感染人数已经超过244万，累计死亡逾17万例。

2003年SARS-CoV的出现，使公众和许多科学家首次意识到冠状病毒及其在人类中造成致命感染的潜力。这轮新的人类冠状病毒引发的疫情则再度激起了该领域研究人员的“热情”。在美国微生物学家Susan R. Weiss看来，每一次类似SARS疫情或新冠疫情这样的大流行，都会促使研究人员涌入这个领域，而随着病毒的消失，研究人员又会减少。至今科学界对人类冠状病毒仍充满诸多未知。




Susan R. Weiss

Weiss研究冠状病毒已长达40年。她于1971年毕业于布兰代斯大学（生物学），随后在哈佛大学获取博士学位，在那里的四年时间里她研究了致命的新城疫(ND，新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病)。Weiss在加利福尼亚大学旧金山分校做博士后研究期间开始研究冠状病毒。当时，除了冠状病毒会导致人类的普通感冒之外，人们对冠状病毒的影响知之甚少。

在她刚进入冠状病毒领域的时候冠状病毒研究人员远没有如今之多。1980年秋季，第一届国际冠状病毒会议在德国维尔茨堡召开，当时Weiss受邀请参加了此次会议，当时出席会议的有大约60人，这几乎是当时该领域的全部研究人员。

目前，Weiss是美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的微生物学教授，她的研究聚焦冠状病毒的生物学，包括SARS、MERS和新出现的新冠病毒。2020年，新冠疫情暴发之际，Weiss被任命为宾夕法尼亚大学冠状病毒和其他新兴病原体研究中心的联合主任，该中心希望加速关注新冠病毒的研究。

日前，美国《实验医学杂志》（Journal of Experimental Medicine，JEM）上发表了Weiss的一篇观点文章。她写道，“我研究冠状病毒已经有40多年了。这一观点文章总结了在SARS流行之前冠状病毒研究的一些主要发现，以及它们如何为当前对新出现的新冠病毒的研究提供信息。”她认为，SARS-CoV、MERS-CoV呈现出来的诸多不同也许在警告我们，冠状病毒可能以不同的方式出现并以不同的模式传播，“正如我们从SARS-CoV-2中观察到的那样。”

附全文翻译：

冠状病毒40年

一种致命的新型冠状病毒目前威胁着全世界大部分人口。导致COVID-19疾病的新冠病毒（SARS-CoV-2）被认为来源于蝙蝠，通过中间宿主最终感染了人类。随后，它蔓延到全球各地，带来了持续的毁灭性影响。这一轮的人类冠状病毒疾病是在2002年SARS-CoV和2012年的MERS-CoV之后出现的，这两者都是和新冠病毒相关的致命性冠状病毒。SARS-CoV的出现，使公众和许多科学家首次意识到这类病毒及其在人类中造成致命感染的潜力。事实上，每次这样的事件都促使研究人员涌入这个领域。然而，早在20世纪30年代就开始了对冠状病毒的研究，这为研究这些人类致病原建立了一个庞大的知识库和技术工具。我从博士后后期，也就是上世纪70年代后期开始研究冠状病毒，直到现在。我想回顾一下过去40年在该领域的一些主要发现，总结在图1中，并指出它们如何与当前的冠状病毒暴发相关。

图1

20世纪70年代末和80年代初，冠状病毒的研究人员还只是一个小群体。当时我在加利福尼亚大学旧金山分校从事博士后工作，与J. Michael Bishop和Harold Varmus一起完成对禽肉瘤病毒RNAs后，我意识到我不想继续在这个领域工作。

在阅读文献时，我发现冠状病毒是一个很有吸引力的话题，而且可能性很大。模型冠状病毒小鼠肝炎病毒（MHV），很容易在实验室的组织培养中生长，也为人类疾病，特别是肝脏和中枢神经系统疾病提供了引人注目的小鼠模型。当时在加利福尼亚大学大学圣地亚哥分校的Julian Leibowitz研究MHV，他非常慷慨地与我分享了他的病毒和细胞。当时我和Julian一起工作，在过去的40年里，我们一直是朋友和合作者。直到很久以后，我才意识到博士后期间Mike Bishop给了我宝贵的经历，让我在他的实验室里开始了自己未来的研究。

由Volker ter Meulen组织的第一届国际冠状病毒会议于1980年秋季在德国维尔茨堡召开，同年9月，我作为宾夕法尼亚大学微生物系（也就是现在的佩雷尔曼医学院）的助理教授开启了我的实验室。当时ter Meulen博士正途径费城，他邀请我参加这次会议。出席会议的有大约60人，这几乎是当时所有研究冠状病毒的科学团体。这是一个RNA基因组和复制策略被发现的时代。虽然许多讨论集中在模型冠状病毒(MHV)上，但也有人介绍了家养动物重要冠状病毒的复制，包括传染性支气管炎病毒和牛冠状病毒。有一些关于人类冠状病毒229E的报告，这是一种知之甚少的引发普通感冒的病原体。

会议结束后，在我的教授Neal Nathanson和神经科教授Don Gilden的鼓励和指导下，我很高兴能将研究扩展到利用脑炎/慢性脱髓炎和肝炎的MHV动物模型。虽然离我熟悉的分子生物学领域很远，但这是一个新的、令人兴奋的探索方向。在20世纪80年代和90年代，我们利用动物模型取得了基础性的发现，在后来的几年里，由于使用了通过反向遗传学获得的基因修饰病毒株，这些发现获得极大进展。事实上，我的职业生涯与冠状病毒研究同步发展。也正是在这段时间里，我晋升为副教授（1986年）和教授（1992年）。

20世纪80年代，冠状病毒领域报告了几个重要的发现。冠状病毒基因组RNA转录成一组编码病毒蛋白的亚基因组mRNA。使用模型MHV，这些亚基因组RNA显示每个mRNA都包含一个由5’末端衍生出来的先导序列，最初是通过RNA指纹方法得到的。这些嵌套的亚基因组RNA确定了一个更大的巢式病毒目（Nidoviruses）超级家族。后来发现，亚基因组mRNA是从全长基因组RNA合成的负链RNA转录而来，这是一种涉及基因组非连续转录的独特机制。这导致冠状病毒重组率高，可能在病毒进化和物种间感染中发挥作用。然而，SARS-CoV-2的祖先蝙蝠病毒、该病毒从该物种转移到人类，以及导致这种高致病性病毒进化的序列变化尚未被确定。

病毒粒子含有入侵所需的遗传物质和结构蛋白。Kathryn Holmes和Larry Sturman对病毒结构蛋白的早期研究表明，MHV刺突糖蛋白（S，最初称为E2）作为一个前体蛋白被合成，在细胞内处理时被细胞酶弗林（furin）裂解为亚单元S1和S2。感染过程中的细胞间融合需要S蛋白裂解，而S蛋白的裂解也依赖于细胞类型和病毒株。很久以后，人们发现二次裂解S2’暴露了融合肽，因此是病毒入侵的必要条件。这些早期发现为后来关于SARS-CoV和MERS-CoV的许多研究提供了依据，这些研究确定了裂解发生的位置和由哪些蛋白酶进行裂解。这些看似微妙的研究表明，这些细节影响进入途径、细胞和器官的趋向性，以及可能的抗病毒靶点。SARS- CoV-2序列在暴发后几周内公布，可以清楚地看到, 不同于SARS-CoV和其他密切相关的蝙蝠病，SARS-CoV-2的S蛋白在S1/S2交界处有一个弗林蛋白裂解位点。这对病毒进入途径和可能的蛋白酶抑制剂作为抗病毒药物有影响，并可以试图推测病毒的毒性和发病机制。有趣的是，这个新的弗林位点可以作为一个标记来识别一个可能的前体病毒。

除了病毒糖蛋白裂解影响趋向性外，确定每个冠状病毒使用的细胞受体也为我们了解感染提供了信息。1991年，Kathryn Holmes鉴定MHV受体为CEACAM1a(MHVR)，它是一种癌胚抗原家族成员，是最早被鉴定的病毒受体之一。随后，分别鉴定出SARS-CoV利用ACE2作为受体、MERS-CoV利用DPP4作为受体，而在短时间内也发现，ACE2也是SARS-CoV-2的受体。然而，虽然了解受体的表达模式可以确定哪些细胞可以被感染，但这并不意味着所有表达受体的细胞，甚至是表达最高的细胞都是主要目标。MHV的研究证实了这一点，在MHV研究中，受体MHVR在肝脏中高度表达，但在神经元中几乎检测不到。然而，在感染期间，MHV毒株JHM.SD具有高度的神经毒性，但不能在肝脏中复制。我们花了相当多的时间和精力来确定病毒在体内的趋向性和致病因素。也许会令人惊讶，我们的研究表明，不仅是S蛋白影响组织趋向性，其他“背景基因”，包括核衣壳和复制酶，以及辅助基因，也是趋向性的重要决定因素。因此，我们不能仅从对S蛋白和受体的了解来推断其发病机制。未来对SARS-CoV-2的研究将确定组织趋向性，以及它是否与SARS-CoV一致。

20世纪80年代，RNA基因组测序很困难，而cDNA克隆那时才刚刚兴起。冠状病毒的第一个完整基因组序列在1987年获得，来源于传染性支气管炎病毒，几年后完成了MHV病毒。这些基因组是由许多短的cDNA克隆组装而成的，组装完毕后基因组约为30kb，比此前用蔗糖密度梯度离心法估计的要长得多，并且是已知RNA病毒中最长的。这些序列显示了两个长开放阅读框，编码16个非结构蛋白的ORF1a和ORF1b。研究还表明，ORF1a和ORF1ab蛋白都是由基因组RNA翻译而来，而ORF1b则是通过ORF1a末端的翻译框移位而来，这揭示了新的翻译控制机制。Alexander Gorbalenya对ORFs1a和ORF1b中编码的蛋白质的深入分析揭示了复制和免疫逃避所需的几种蛋白酶和其他酶域。SARS-CoV出现后，科学家更加清楚，在不同的冠状病毒中存在一些酶和蛋白质，还有一些种特异性的所谓的附属蛋白。了解这些病毒编码蛋白的作用，无疑将揭示这些病毒如何逃避宿主定向反应。此外，针对冠状病毒家族中保守的一种重要酶的抗病毒药物，最终可作为广谱抗冠状病毒治疗药物。事实上，目前使用抗病毒药物瑞德西韦（remdesivir）的试验，其靶标就是保守的RNA依赖的RNA聚合酶，可能确实对大量的冠状病毒有效。

事实上，这些冠状病毒附属基因在先天免疫逃避和发病机制中起了重要作用。我们发现，鲜为人知MHV蛋白质NS2是宿主先天免疫的肝脏特异性拮抗物，和Robert Silverman（现在是我的长期合作者和朋友）一起，我们发现NS2是裂解2-5A（可激活抗病毒OAS-RNase L通路）的磷酸二酯酶。这一新的研究方向使我们两个研究小组探索了该通路在感染多种病毒时激活和拮抗的几个方面，以及在某些自身免疫性疾病状态下积累的内源性双链RNA。重要的是，我们发现OAS-RNase L是一种主要途径，可在病毒感染早期或感染病毒期间激活，阻断IFN的产生或信号转导，在蝙蝠细胞和人类细胞中也是如此。在此期间，我们发现MERS NS4b是NS2的结构同源物，但在其主要的核定位中与其他病毒的磷酸二酯酶不同，这是我们目前的研究方向。这一新且仍在进行的研究方向使得我们获得了MERS-CoV先天免疫调节的新发现。

早期冠状病毒研究的另一个主要障碍是缺乏反向遗传系统，这在一定程度上是由于克隆30kb RNA非常困难。1992年，Paul Masters等人开发了一个重组系统，200年，Luis Enjuanes等人在细菌人工染色体中构建了一个全长基因组复制，同年，Ralph Baric等人获得了全长的传染性cDNA克隆。在这些和其他新兴技术出现之后，多个冠状病毒的遗传系统很快获得。这使得遗传研究得以揭示基础生物学和病毒发病机理的新见解，也得以快速构建新兴冠状病毒SARS-CoV和MERS-CoV的克隆。令人惊讶的是，Volker Thiel和他的同事在2020年的一份最新报告中描述了在酵母系统中快速克隆的SARS-CoV-2基因组。这些遗传系统是揭示发病机制和免疫控制的基础。

冠状病毒是SARS流行的病原体这一发现震惊了冠状病毒学家们，我们都开始使用之前所学的知识来研究新的SARS-CoV。现在大家都知道，但当时并不确定，SARS在暴发6-7个月后就消失了，导致了8069人感染和774人死亡。随着病毒的消失，研究冠状病毒的人员也减少了。在SARS流行之后，发现了另外两种人类冠状病毒，2004年发现的NL63和2006年发现的HKU1。另一个值得注意的发现是，蝙蝠是许多SARS样冠状病毒的宿主。2012年，更致命的MERS-CoV病毒出现，这重新激起了人们对冠状病毒的广泛兴趣。然而，在MERS-CoV的出现中存在着重要的差异，骆驼是该病毒的“蓄水池”，并一直延续到今天，从骆驼传播到人类。也许这应该警告我们，冠状病毒可能以不同的方式出现并以不同的模式传播，正如我们从SARS-CoV-2中观察到的那样。

最近暴发的SARS-CoV-2已经使全球陷入瘫痪，科学界也再次被动员起来。我的实验室最近开始利用我们的专业知识对SARS-CoV-2进行调查，包括我们自己在病毒-宿主相互作用方面的工作，以及与他人在从诊断到抗病毒药物等各种问题上的合作。此外,可喜的是,曾经跟我训练的很多人是也在为对抗这种病毒而努力，包括Scott Hughes（纽约安全、应急准备与响应办公室）、Kristine Rose（流行病防范创新联盟CEPI），以及其他一些从事SARS-CoV-2研究的人。希望我们从以前的冠状病毒中获得的所有知识将加速抗病毒药物的发现和疫苗的开发，以及病毒的来源和它的祖先。希望这一次我们能学到足够的东西来预防或快速应对未来的疾病暴发。或许具有讽刺意味的是，由于SARS-CoV-2的原因，原定于2020年5月召开的第十五届国巢式病毒研讨会被推迟了一年。我们热切地期待着日益庞大的冠状病毒研究群体下一次面对面的聚会。

原文链接：https://rupress.org/jem/article/217/5/e20200537/151597/Forty-years-with-coronavirusesForty-years-with 阅读原文